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ROTOR自动化技术——快速构建高通量酵母文库

点击次数:541 发布时间:2020-11-06

酿酒酵母突变文库是系统生物学研究的理想模型。因此酵母菌文库有非常重要的意义,但由于其含有标记标签和调和因子的比较罕见,要构建是非常昂贵和费力的。

—Nat Methods. 2016 Apr; 13(4): 371–378.

 

事实证明,系统性文库对酵母菌内的全基因组研究有重大的意义—实例包括酵母基因敲除文库和酵母GFP文库。每个文库都能让人们对酵母生物学的各个方面进行全新的认识,然而,建立酵母文库需要付出巨大的努力,这常常掩盖了酵母文库本身的价值。无休止的转化、挑取、克隆和验证工作,成本巨大,工作流程冗长,使科学家对解决其他新的生物学问题望而却步。
 

海德堡大学Michael Knop实验室的Anton Khmelinskii和Matthias Meurer开发了一种无缝基因标记方法,以减轻文库构建过程中面临的问题。他们与以色列魏茨曼科学研究院的Maya Schuldiner实验室的IdoYofe和Uri Weill一起,将这种方法进一步发展为SWAp-Tag法。利用ROTOR,此方法可以在短短三周内快速构建文库。

 

 

文章来源:(2016) One Library to make them all: Streamlining yeast library creation by a SWAp-Tag (SWAT) strategy. Nature methods 13: 371-378

作者:Yofe, I., Weill, U., Meurer, M., Chuartzman, S., Zalckvar. E., Goldman, O., Ben-Dor, S., Schütze, C., Wiedermann, N., Knop, M., Khmelinskii, A. and Schuldiner, M.

 

SWAp-Tag (SWAT)技术

 

SWAp-Tag(SWAT)法依赖于初始受体库的生成。该受体库充当模板,可以以“即插即用”的方式交换到其他文库中。

该文库的构建方法很有特色,因为它需要一个一次性传统方法构建的受体菌株文库,受体模块插入到已知的基因组位置。通过将受体文库与含有表达所需要模块的供体株配对,可以用新的标记、启动子或其他所需的基因组序列替换该受体模块。这样可以轻松,准确且经济高效地创建无数个新的文库。

 

 

SWAT法可以快速直接地生成系统文库:

(a)整合SWAT受体模块在N'末端标记蛋白质。

(b)利用ROTOR让受体菌株与供体菌株杂交来生成新文库。再用ROTOR来选择单倍体孢子并诱导I-SceI表达。

(c)潜在的供体质粒(顶部),可用于创建基因标记文库(底部)
 

SWAT技术的特点:快速、灵活、免费

 

Schuldiner和Knop实验室创建了一种创新的、极其快速的文库构建方法,它可以通过合成不同模块,轻松生成文库,而不是从头开始为每个模块创建新的文库。在获得或构建一个受体文库后,一个新的文库可以在短短三周内生成,并可以立即用于全基因组研究。Schuldiner实验室已经创建了一个原始的受体N' -SWAT文库,该文库的N端标记为组成性表达的GFP。此外,此外,使用SWAT法从原始受体库中又获得了另外两个文库:N’mCherry-tag库和N’ GFP库。现在可以从Maya Schuldiner教授已发表的SWAT文库中免费获得GFP-tag、mCherry-tag或GFP荧光文库。

这种方法的瓶颈是杂交和筛选的步骤。Schuldiner和Knop实验室使用Singer Instruments公司的ROTOR来突破这些瓶颈。因此,用ROTOR处理菌株,杂交、产孢,标签交换筛选/计数筛选、被用来处理所有的应变,交配和产孢程序,标签交换选择/反选择,以及在文库中筛选成功的集成模块。

 

 

这一迅速的过程意味着科学家可以在他们灵活地创建和可视化从未见过的蛋白质。标签介导的定位问题已通过SWAp-TAG方法解决,因为它使ORFs可以在5'或3'末端进行标记,大幅地减少错位或蛋白质不稳定的影响。
 

“Creation of new libraries would not have been possible without our Singer ROTOR robot”.

——Prof. Maya Schuldiner – 2017

 

 

SWAT技术的应用和意义

 

从理论上讲,任何标签都可用于从N’-SWAT受体库中构建新的文库。该标签可以用于共定位研究的不同颜色荧光,也可以是用于测量蛋白质-蛋白质相互作用的互补标签。一旦生成了C’-SWAT受体文库,无论是定量转录和翻译效果的启动子、UTR还是其他非编码DNA,基因5’或3’末端的任何部分都可以被修改。半衰期可以用定时荧光来研究,或用下拉标签来分离蛋白质。

SWAT法生成文库,节省了很多宝贵的时间,使研究人员可以设计更多有意义的实验,这也为系统探索细胞生物学的未知领域打开了一扇大门。Schuldiner实验室已经将N'SWAT文库用于共定位筛选、过表达筛选以及体内观察相互作用。正如Schuldiner教授所说:“乐趣无穷!”。



 

ROTOR

合适的工具是实验成功的关键

 

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